کلونینگ و بیان پیولیزین تروپرلا (آرکانوباکتریوم) پیوژنز و بررسی اثر محافظت کنندگی توکسوئید آن در گوسفند

تروپرلا (آرکانوباکتریوم) پیوژنز، باعث ایجاد عفونت هایی در حیوان و انسان می شود. پیولیزین مهم ترین فاکتور حدت این باکتری است، که در این مطالعه توان محافظت کنندگی توکسوئید نوترکیب آن در گوسفند مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور ابتدا id50 این باکتری در گوسفند تعیین گردید. جهت تعیین id50، چهار گروه از بره های 2 تا 3 ماهه (سه بره در هر گروه) با مقادیر 107، 108، 109 و 1010 واحد تشکیل دهنده کلونی (cfu) از تروپرلا پیوژنز از طریق ورید وداج آلوده گردیدند. گروه پنجم به عنوان شاهد سرم فیزیولوژی استریل دریافت نمودند. تا 10 روز پس از آلودگی تمامی بره ها از نظر علائم کلینیکی و سپتی سمی مورد پایش قرار گرفته و در روز دهم پس از کشتار از نظر ضایعات پاتولوژیک و آلودگی باکتریایی اندام های داخلی، مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج دال بر آلودگی شاخص کبدی تمامی بره های آلوده شده باcfu 1010 و ریه یکی از بره های آلوده شده با cfu 1010 از باکتری بود. id50 این باکتری با روش reed و munch برای بره های 2 تا 3 ماهه، cfu109 × 162/3 محاسبه گردید. در مرحله ی بعد، اقدام به کلونینگ ژن 1506 جفت بازی پیولیزین در پلاسمید pmalc2x و انتقال آن به باکتری اشرشیا کلی tg1 گردید، که تعیین ردیف نوکلئوتید های پلاسمید نوترکیب حاصله دال بر کلونینگ موفقیت آمیز پیولیزین بود. با توجه به عدم بیان مناسب پیولیزین در سویه اشاره شده، اقدام به انتقال پلاسمید نوترکیب به اشرشیا کلی bl21(de3) گردید که sds-page، وسترن بلات و بررسی فعالیت همولیتیکی مایع حاصل از سونیکاسیون کلون بدست آمده، دال بر بیان موفقیت آمیز پیولیزین 55 کیلودالتونی در سویه bl21(de3) بود. شرایط بهینه بیان این پروتئین در این سویه، گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 3 ساعت در حضور iptg بود، و در این شرایط مقدار مورد نیاز از پیولیزین نوترکیب تولید و تحت تاثیر فرمالین به توکسوئید تبدیل شد. پس از تعیینid50 و تهیه توکسوئید پیولیزین نوترکیب، توان محافظت کنندگی آن در گوسفند در برابر چالش با تروپرلا پیوژنز مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور،10 راس بره 2 تا 3 ماهه به دو گروه 4 (شاهد) و 6 (درمان) راسی تقسیم گردیدند. بره های گروه درمان 100 میکروگرم توکسوئید پیولیزین نوترکیب همراه با آدجوانت کامل فروند از طریق زیر جلدی و سپس به فاصله دو هفته، مقدار مشابهی از آنتی ژن اما توام با آدجوانت ناقص فروند دریافت نمودند. به بره های گروه شاهد تنها آدجوانت به همراه سرم فیزیولوژی استریل تزریق گردید. به منظور بررسی پاسخ هومورال، تمامی بره هابه صورت هفتگی تا پایان دوره، مورد خونگیری و اندازه گیری عیار ضد پیولیزین قرار گرفتند. تمامی بره ها دو هفته پس از تزریق دوم باcfu 1010 از باکتری چالش شده و تا 10 روز پس از چالش از نظر علائم کلینیکی و سپتی سمی مورد پایش قرار گرفته و سپس کشتار و از نظر علائم پاتولوژیک و آلودگی باکتریایی مورد بررسی قرار گفتند. باکتری مورد نظر به طور کامل از بره های گروه درمان حذف شده بود ولی تمامی بره های گروه شاهد آلودگی شدید کبدی به این باکتری را داشتند. به نظر می رسد که پیولیزین نوترکیب می تواند محافظت قابل قبولی را در برابر عفونت ناشی از تروپرلا پیوژنز ایجاد نماید و ممکن است بتوان از آن در تولید واکسن های ضد این عامل استفاده نمود